Descrierea analizelor 

FUNCȚIA NORMALĂ A TRACTULUI GASTROINTESTINAL

Tractul gastrointestinal este una dintre cele mai mari interfețe dintre mediul intern uman și lumea exterioară. Funcția sa este de a digera și de a absorbi substanțele nutritive esențiale furnizate de alimente. În același timp, asigură și o barieră care împiedică moleculele care pun în pericol sănătatea să treacă prin mucoasa intestinală și să ajungă în circulația sistemică.

Disfuncțiile intestinale sunt în prezent considerate factori care contribuie la numeroase boli cronice, cum ar fi alergiile, tulburările autoimune, tulburările inflamatorii și bolile degenerative.

DISBIOZA INTESTINALĂ

Microflora intestinală reprezintă un ecosistem cu un grad ridicat de complexitate. Microflora nu numai că joacă un rol esențial în digestia și absorbția nutrienților, în sinteza vitaminelor și a acizilor grași, în detoxificarea substanțelor chimice ingerate, ci și în reglarea sistemului imunitar. Modificările în compoziția microflorei pot, așadar, să aibă consecințe grave pentru sănătatea gazdei. O tulburare frecventă a funcției intestinale este disbioza. Aceasta este o proliferare a bacteriilor patogene în intestin. Se estimează că tractul intestinal uman adult găzduiește până la 50 de genuri diferite de bacterii, reprezentând peste 500 de specii diferite.

• Utilizarea antibioticelor reprezintă o cauză uzuală a modificărilor majore. Dozajul, durata administrării, spectrul de acțiune determină impactul asupra florei microbiene.
• Stresul psihologic poate afecta, de asemenea, compoziția florei, inclusiv o scădere semnificativă a bacteriilor benefice (Lactobacilli și Bifidobacteria) și o creștere a E. coli patogene. Stresul poate afecta proliferarea bacteriană prin reducerea semnificativă a producției de mucopolizaharide și mucine, care sunt importante pentru inhibarea aderenței organismelor patogene și prin scăderea producției de imunoglobulină A (IgA), care joacă un rol esențial în eliminarea lor. Neurochimicele produse pe bază de stres psihologic pot, de asemenea, spori direct dezvoltarea organismelor patogene: norepinefrina stimulează creșterea Y. Enterocolitica, P. Aeruginosa și a bacteriilor gram-negative cum ar fi E. coli.
• Un alt factor care poate avea un impact asupra florei intestinale umane este dieta. Unele diete favorizează dezvoltarea microorganismelor benefice, în timp ce altele favorizează activități microflorale dăunătoare. De exemplu, dietele bogate în compuși cu sulf (produse lactate, ouă, anumite legume, fructe uscate …) favorizează creșterea bacteriilor care reduc sulfatul. La nivel global, se pare că populațiile care au o dietă tipic occidentală au mai multe bacterii anaerobe, mai puțin enterococi și mai puține tipuri de drojdii decât populațiile care consumă o dietă vegetariană sau pe bază de carbohidrați complecși.

PERMEABILITATEA INTESTINALĂ: SINDROMUL INTESTINULUI PERMEABIL

Mucoasa intestinală sănătoasă absoarbe în mod normal moleculele mici care rezultă din digestia completă. Celulele intestinale conțin proteine transportoare specializate, care transportă substanțe nutritive prin peretele intestinal și în sânge. Moleculele mai mari nu vor fi transportate de aceste sisteme și în mod normal sunt păstrate în interiorul intestinului deoarece celulele mucoasei intestinale sunt grupate împreună. Sindromul intestinului permeabil (LGS) este o afecțiune în care capacitatea peretelui intestinal de a ține la distanță moleculele mari și nedorite este redusă. Când spațiile dintre celulele peretelui intestinal se extind, macromoleculele, antigenele și toxinele vor ajunge în sânge.

Un număr mare de factori pot conduce la un intestin permeabil:

• Componente din alimentație: fermentarea anumitor componente din alimentație (proteine, carbohidrați rafinați) conduce la produse finite cu potențial dăunător: amoniac, amine, fenoli, sulfuri … acești compuși reduc durata de viață a celulelor mucoasei. Aditivii alimentari, alcoolul, cofeina irită peretele intestinal.
• Disbioza intestinală: producția de compuși toxici prin fermentație depinde, de asemenea, de tipul de bacterii prezente în intestin. În cazul disbiozei, bacteriile patogene supradimensionate produc toxine și compuși care sunt foarte dăunători pentru celulele intestinale. De exemplu, bacteriile sulfat reducătoare produc hidrogen sulfurat toxic.
• Alergii și intoleranțe alimentare: intoleranța la anumite alimente (lactoză …) poate duce la inflamația intestinală dăunătoare.
• Stresul cronic: în afară de faptul că favorizează disbioza, stresul reduce fluxul sanguin la nivelul intestinului, lăsându-l în imposibilitatea de a se repara. Stresul provoacă, de asemenea, contracția celulelor intestinului, ceea ce duce la spații mai mari între celule.

Consecințele intestinului permeabil

Permeabilitatea modificată a peretelui intestinal poate avea efecte foarte dăunătoare, inclusiv:

• Carențe nutriționale: sistemele purtătoare care transportă în mod normal substanțele nutritive prin peretele intestinal sunt mai puțin active în celulele mucoaselor deteriorate sau inflamate.
• Absorbția crescută a toxinelor din mediu: mucoasa intestinală este în mod normal o barieră eficientă împotriva produselor chimice din mediu prezente în produsele alimentare (aditivi alimentari, pesticide, BPC …). Când li se permite să ajungă în circulația sângelui, aceste toxine pot provoca leziuni tuturor organelor, în special ficatului și creierului. Se pot dezvolta sensibilități chimice multiple deoarece sistemul nervos se sensibilizează.
• Dezvoltarea alergiilor și a reacțiilor autoimune: moleculele nedigerate, de mari dimensiuni, trec în sânge. Sistemul imunitar recunoaște aceste molecule ca fiind străine și folosește anticorpi împotriva lor. Ca urmare, pacienții afectați vor dezvolta alergii la multe tipuri de alimente, ceea ce dă naștere unui cerc vicios, deoarece alergiile vor provoca inflamația intestinală care conduce la o mai mare permeabilitate intestinală … În plus, unele dintre moleculele care trec în sânge pot avea omologi comuni cu proteinele care sunt în mod normal prezente în organism. Anticorpii împotriva acestor molecule vor ataca, prin urmare, celulele proprii ale organismului, ducând la boli autoimune.
• Activarea cronică (inflamație) a sistemului imunitar: un compus bacterian care își poate face cu ușurință drum către sânge este lipopolizaharida (LPS). Prezentă în fluxul sanguin, LPS va induce un răspuns pro-inflamator puternic în monocite și macrofage, implicând recunoașterea printr-un receptor (receptorul Toll-like 4) și secreția ulterioară a citokinelor, cum ar fi IL-1, IL-6, TNF-alfa. Printre astfel de afecțiuni cronice inflamatorii se observă sindromul de oboseală cronică (CFS / ME). LPS induce, de asemenea, producția de oxid nitric mediată de NK-kB. Deoarece ON este crescut, funcția NK este inhibată și se observă adesea infecții oportuniste, cum ar fi infecțiile cu micoplasme. Herpesvirusurile care tind să reactiveze în contextul activării imunitare, vor fi, de asemenea, detectate frecvent.

SINDROMUL DE COLON IRITABIL (SCI)

Dintre patologiile care se dezvoltă în urma disbiozelor intestinale și a intestinului permeabil, cea mai frecventă este probabil sindromul de colon iritabil (SCI). SCI este caracterizat prin durere sau disconfort abdominal, împreună cu semne de disfuncție intestinală, cel mai frecvent diaree și / sau constipație. Cifrele actuale sugerează că 10-20% din populație poate suferi de această boală. Se consideră că SCI este rezultatul activării necorespunzătoare și cronice a sistemului imunitar mucozal. Cauzele acestei activări nu sunt clare, boala este, probabil, multifactorială. Factorii care pot juca un rol în SCI includ:

• Disfuncția neurologică și interacțiunea creier-intestin

• O evoluție majoră în studiul SCI și al altor boli gastrointestinale a fost înțelegerea influenței sistemului nervos asupra acestor tulburări. Intestinul prezintă cea mai mare concentrație de celule nervoase din organism, pe lângă creier. Există o comunicare constantă între creier și intestin, iar neurotransmițătorul serotonină, produs de celulele nervoase, poate exercita o gamă largă de efecte asupra intestinului, cel mai important fiind controlul motilității intestinale și al secrețiilor intestinale.
• Studiile recente sugerează că pacienții cu SCI prezintă niveluri crescute de serotonină; administrarea de substanțe asemănătoare serotoninei subiecților testați pare să declanșeze simptomele SCI. Alte studii au indicat anomalii în modul în care serotonina acționează la pacienții cu SCI. Aceste anomalii ale nivelelor și funcțiilor serotoninei pot determina în mod direct anomalii ale funcției intestinale.
  • Stresul
• Mult timp s-a crezut că stresul joacă un rol major în SCI. Datorită concentrației mari de celule nervoase din intestin, orice modificare a funcției creierului datorată stresului poate avea un impact ușor asupra funcției intestinale. Stresul cronic conduce la inhibarea cronică a funcției intestinale. După cum s-a discutat mai sus, stresul poate favoriza disbioza intestinală și intestinul permeabil; stresul provoacă, de asemenea, eliberarea de substanțe chimice inflamatorii în intestin, cum ar fi substanța P, și poate activa inflamația intestinului când survine împreună cu un alt factor, cum ar fi o infecție.
  • Sensibilități și intoleranțe alimentare; boala celiacă
• Consumul anumitor alimente poate exacerba simptomele SCI. Într-un studiu recent, pacienții cu SCI au fost testați pentru reacții IgG la diferite alimente (IgG indică sensibilități alimentare, mai degrabă decât alergii alimentare clasice care implică IgE). Pacienții au fost apoi trecuți pe o dietă care a exclus alimentele la care au fost testați pozitiv; aceste diete de eliminare au dus la o reducere semnificativă a simptomelor. Un caz particular de intoleranță alimentară este boala celiacă. S-a constatat că un subgrup de pacienți cu SCI prezintă o boală celiacă ușoară / moderată, care este o intoleranță la gluten (reacție imună la proteina glutenului care va provoca leziuni intestinului). Persoanele cu boală celiacă trebuie să evite alimentele care conțin gluten, cum ar fi grâul, secara, orzul și ovăzul.
  • Disbioza intestinală
• După cum s-a discutat mai sus, consecințele disbiozei includ disconfort intestinal, intestin permeabil, alergii alimentare, inflamație intestinală, toate fiind asociate cu SCI.
• Cercetările au arătat de fapt că pacienții cu SCI au un număr redus de bacterii benefice (lactobacili și bifidobacterii) și un număr anormal de mare de organisme facultative care fermentează reziduurile alimentare pentru a produce cantități mari de gaze și deșeuri toxice.
  • Factori genetici
• Se pare că există factori genetici care predispun la dezvoltarea SCI: rudele apropiate ale unei persoane cu SCI sunt de 4 până la 20 de ori mai predispuse să dezvolte boala decât populația generală. Identificarea unei mutații genetice exacte a fost până acum greu de realizat, totuși rezultatele recente sugerează o implicare a genelor relevante la inflamație în general (citokine), precum și a genelor care codifică receptorii Toll-like (în special TLR-4, care recunoaște LPS).

Reglarea funcției imune în intestin:

• 80% din celulele noastre imune se află în intestin
• Țesutul limfoid asociat tractului gastrointestinal (GALT) este răspândit de-a lungul mucoasei intestinale (plăcile lui Peyer în intestinul subțire, foliculii limfoizi din colon) și conține 80% din celulele imune ale organismului
• Aceste celule imune interacționează permanent cu microorganismele asociate cu mucoasa (bacterii, viruși …)
• Se menține un echilibru delicat între toleranța la antigene intestinale (diminuarea inflamației, …) și apărarea împotriva agenților patogeni (producția defensinelor, …).

Dezechilibrul imunității intestinale afectează întregul corp:

• Integritatea barierei intestinale este esențială: creșterea permeabilității mucoasei determină endotoxemia sistemică (inflamația cronică scăzută) și reacțiile anormale ale imunității la antigenele intestinale
• Interacțiuni gazdă / floră intestinală: flora microbiană intestinală joacă un rol major în menținerea sănătății gazdei, dar poate fi afectată de funcționarea anormală a imunității gazdei.

În prezent se consideră că modificările în flora intestinului reprezintă factori care contribuie la numeroase boli cronice, cum ar fi alergii, tulburări autoimune și inflamatorii sau boli degenerative.

Un anumit număr de factori, cum ar fi utilizarea antibioticelor, stresul, anumite componente dietetice, pot avea un impact dăunător asupra microflorei intestinale. Excesul de bacterii patogene conduce la producerea de compuși bacterieni toxici (cum ar fi endotoxinele) care sunt absorbiți în sânge și provoacă activarea imună anormală.

Inflamația intestinală care poate rezulta din intoleranțe sau alergii alimentare, conduce la o permeabilitate crescută a peretelui intestinal („intestin permeabil”), facilitând trecerea compușilor bacterieni în sânge.

Autismul și inflamația gastrointestinală:

• Mai multe rapoarte au indicat o prevalență ridicată a simptomelor gastrointestinale, inflamației și disfuncției la copiii cu autism (revizuit de Horvath și Perman, Curr Gastroenterol Rep 2002).
• Au fost observate grade ușoare până la moderate de inflamație atât în tractul intestinal superior, cât și în cel inferior. La copiii cu tulburări de spectru autist, prezența disfuncției IG este adesea asociată cu iritabilitate crescută, accese de furie, comportament agresiv și tulburări de somn (revizuit de Critchfield și colab., Gastroenterol Res Pract. 2011).

Analize ELISA sIgA în probele de materii fecale (sIgA)

Funcția cheie a sIgA este să se lege de microorganismele și toxinele invadatoare și să le prindă în stratul de mucus sau în celulele epiteliale, inhibând astfel motilitatea microbiană, aglutinând organismele și neutralizând exotoxinele acestora și apoi ajutând la eliminarea lor inofensivă din organism în fluxul fecal. De asemenea, sIgA „etichetează” alimentele ca fiind acceptabile, astfel încât sIgA scăzut duce la o sensibilitate crescută la alimente.

Concentrația sIgA ne oferă informații despre apărarea imună intestinală:

Lipsa sIgA indică o diminuare a activității sistemului imun intestinal

Un nivel crescut al sIgA indică inflamația intestinală.

Markerii inflamației în probele de materii fecale (C / INFL)

Hemoglobina: evacuată cu fecalele în bolile hemoragice gastrointestinale

Transferina: o componentă derivată de sânge; un marker bun pentru hemoragia gastrointestinală

Calprotectina: o proteină citosolică neutrofilă cu proprietăți antimicrobiene, care este prezentă în concentrație crescută în fecale în timpul inflamației intestinului

Lactoferina: o componentă glicoproteică a granulelor secundare neutrofile, eliberată din leucocite fecale; poate servi ca marker al inflamației în intestin.

Acest test imunocromatografic se efectuează pe materiile fecale și oferă un răspuns calitativ (pozitiv / negativ).

Zonulina în probele de materii fecale (ZONU)

Zonulina reprezintă „poarta de intrare” pentru intestinul permeabil. Zonulina deschide spațiile dintre celulele căptușelii intestinale. Aceasta se întâmplă în mod normal pentru ca substanțele nutritive și alte molecule să intre și să iasă din intestin. Totuși, atunci când intestinul permeabil este prezent, spațiile dintre celule se deschid prea mult, permițând moleculelor de proteine mai mari să pătrundă în sânge, unde poate avea loc o reacție imunologică. De asemenea, poate provoca scurgerea conținutului intestinal, cum ar fi bacteriile, în sistemul imunitar, provocând inflamații. Odată cu creșterea nivelului de zonulină, etanșarea dintre celulele intestinale se diminuează, deschizând spații între celule care permit tuturor feluri de lucruri să pătrundă înăuntru. Aceasta se numește „intestin permeabil”. Zonulina este singurul modulator fiziologic al joncțiunilor intercelulare strânse descrise până în prezent, care este implicată în traficul macromoleculelor și, prin urmare, în echilibrul toleranță / răspuns imunitar.

Analize EPX / EDN ELISA în probele de materii fecale (EPX / EDN)

​

Acumularea neurotoxinei eozinofil-derivate (EDN) în intestin este asociată cu inflamația și deteriorarea țesutului. Măsurarea EDN în materiile fecale poate servi drept parametru obiectiv pentru o inflamație cronică clinică sau subclinică prezentă în zona gastrointestinală.

EDN fecală este considerată cea mai bună dintre proteinele granuloase citotoxice pentru evaluarea inflamației intestinului, deoarece reflectă cel mai bine scorurile clinice, endoscopice și histologice ale activității bolii și leziunilor mucoasei.

Nivelurile ridicate de EDN fecale sunt asociate mai multor afecțiuni inflamatorii, cum ar fi alergia / sensibilitatea la alimente, infecțiile patogene (C. difficile și H. pylori), IBS, tulburările gastrointestinale eozinofile.

Evaluarea infecțiilor în probele de materii fecale

Testele imunocromatografice se bazează pe captarea imunologică a unui coloid colorat atunci când trece printr-o membrană. Pe această membrană a fost imobilizat un anticorp sau un antigen. Detectarea unei posibile infecții este ușoară și rapidă, deoarece nu implică cultivarea probei fecale. Următoarele analize sunt disponibile:

• C/PARAS Cryptosporidium/Giardia Ag
• HPYL Helicobacter Pylori Ag
• SHIG Shigella spp. Ag
• ADENOV Adenovirus Ag
• SALMO Salmonella Spp. Ag
• LIST Listeria monocitogenes Ag
• ENTEROV Enterovirus Ag
• HepA Virusul hepatitei A Ag
• EntaHIST Entamoeba histolytica
• CampBact Campylobacter Ag
• YERSI Yersinia enterocolitica
• CLOSTRICombo Clostridium difficile 3 toxine
• TULAR Tularemia (Francisella tularensis)

Metodă de abordare metagenomică (MSA)

Microflora intestinală (microbiom intestinal) poate fi considerată un organ dobândit postnatal. Alcătuită dintr-o mare diversitate de celule bacteriene, are funcții diferite pentru gazdă. Microflora are un rol semnificativ în maturizarea intestinului, integritatea intestinului, prevenirea colonizării bacteriene patogene și oportuniste, … Modulează și sistemul imunitar. Microflora este, de asemenea, implicată în sinteza vitaminei, producția de acizi grași cu catenă scurtă și metabolizarea substanțelor cancerigene.

Microbiomul contribuie la prelucrarea și metabolizarea alimentelor:

            – digestia și absorbția nutrienților

            – metabolismul zahărului

            – sinteza acizilor grași cu catenă scurtă (de exemplu, sinteza butiratului de Faecalibacterium, Roseburia … este importantă pentru sănătatea colonului … dar dă foarte multă energie -> obezitate)

            – sinteza aminoacizilor și a vitaminelor (vit B12, vit B9, vit K)

            – detoxifierea poluanților și a moleculelor toxice prezente în alimente

            – reglarea funcției imune

Deși flora intestinală este destul de stabilă în timp, o serie de factori pot  perturba echilibrul normal și astfel duce la disbioză intestinală. Microflora intestinală poate fi modificată prin mecanismele imunitare ale gazdei, starea redox, funcția suprarenală, pH-ul intestinal, dieta gazdei, vârsta gazdei, medicamente, organismele exogene și stresul emoțional.
Disbioza intestinală poate fi observată într-o serie de boli cronice, cum ar fi boala Crohn, SCI, CFS și poate fi asociată cu tulburări atopice și de dezvoltare, cum ar fi autismul și ADHD.

Până de curând, cercetările privind compoziția microbiotei s-au bazat aproape exclusiv pe cultură, în ciuda faptului că:

• 40 până la 80% din bacteriile intestinale nu pot fi cultivate
• Identificarea coloniilor poate fi dificilă
• Bacteriile trebuie să fie vii: studierea agenților patogeni anaerobi este foarte dificilă, pierderi majore în timpul colectării și procesării probelor
• Abordarea culturii poate analiza doar o mică parte din toate speciile bacteriene (10%?)
• coli care se credea că este o specie dominantă, este un membru minor …

Flora intestinului și starea gastrointestinală la copiii cu autism sunt corelate cu severitatea autismului:

• Adams și colab. (BMC Gastroenterologie 2011) a raportat că simptomele gastrointestinale au fost puternic corelate cu severitatea autismului. Din cele patru tipuri de bacterii benefice care au fost investigate, copiii cu autism au avut un nivel mult mai mic de Bifidobacterium (-45%), niveluri ușor mai mici de Enterococcus (-16%) și niveluri mult mai ridicate de Lactobacillus (+100%).
• Finegold și colab. (Anaerobe 2010) a raportat că în materiile fecale la copiii de control, Firmicutes a fost prezent în procent de 63,6% din flora totală, dar numai 38-39% din flora materiilor fecale la copiii cu autism. Bacteroidele au reprezentat 30% din flora materiilor fecale de control și 51% din flora materiilor fecale la copii cu autism. Actinobacteriile au constituit 1,8% din flora materiilor fecale la copiii de control și între 0,4 și 0,7% din flora copiilor cu autism. Proteobacteriile au constituit 0,5% din flora copiilor de control și între 2,3 și 3,1% din flora copiilor cu autism. În concluzie, flora fecală a copiilor cu autism a fost semnificativ diferită din punct de vedere statistic de cea a copiilor sănătoși.

Disbioza în sindromul oboselii cronice (CFS):

• O tulburare frecventă a funcției intestinale este disbioza, adică proliferarea bacteriilor patogene în intestin.
• Mai multe studii publicate sugerează că CFS este asociat cu disbioza
  • Analizele pe bază de cultură au evidențiat nivele crescute de Streptococcus și Enterococcus spp. în probe de materii fecale la pacienți cu ME / CFS [Sheedy și colab., In Vivo 2009]
  • Suplimentarea probiotică (L. casei într-un studiu, L. paracasei + L. acidophilus + B. lactis într-un alt studiu) a dus la îmbunătățirea simptomelor emoționale și a funcțiilor neurocognitive [Rao și colab., Gut Pathog 2009; Sullivan și colab., Nutr J 2009].

La laboratoarele R.E.D., am dezvoltat o nouă procedură pentru a analiza culturile bacteriene într-o probă de scaun (publicată de Fremont și colab., Anaerobe 2013). Această procedură de ultimă generație se bazează pe amplificarea PCR de 16 secunde urmată de secvențierea la viteză mare. Acesta oferă o imagine de ansamblu cuprinzătoare a tuturor speciilor bacteriene, inclusiv a celor care nu au putut fi analizate prin tehnici de cultură tradițională.

Analiza noastră metagenomică a materiilor fecale oferă o imagine completă a populațiilor bacteriene prezente într-o probă de scaun, incluzând aerobe, anaerobe și specii bacteriene care nu pot fi analizate prin tehnici de cultură tradițională.

Interes și posibile aplicații:

• Procedură ușoară de colectare, probele pot fi stabilizate: acces facil la pacienți
• Număr mare de aplicații: autism, infecții cronice, CFS, diverse afecțiuni intestinale, obezitate, alergii, cancer …
• Poate urma după intervențiile terapeutice: pre- sau probiotice, antibiotice, extracte de plante, modificări ale dietei …

Poate fi utilizată în studiile clinice.